"Las células madre pluripotentes inducidas humanas ofrecen una plataforma novedosa y conveniente para estudiar tipos de células específicas para la enfermedad de los pacientes afectados y la terapéutica de prueba, y por lo tanto proporcionan un puente entre la investigación clínica y el mercado."
En las últimas dos décadas, las técnicas de avance para el análisis genético y los esfuerzos concertados de los científicos y los médicos han llevado a la identificación de un número considerable de genes implicados en enfermedades degenerativas de la retina. Sin embargo, es necesario centrar las estrategias de tratamiento y evaluar la eficacia de una mayor comprensión de los procesos biológicos afectados por estos genes de la enfermedad. Tradicionalmente, los esfuerzos para obtener tal conocimiento se han basado en sistemas de cultivo de células sustitutas (a menudo el empleo de la sobreexpresión heteróloga) y modelos animales que, si bien es muy valiosa, no puede reproducir los aspectos críticos de la enfermedad humana. Las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) ofrecen una plataforma novedosa y conveniente para estudiar tipos de células específicas para la enfermedad de los pacientes afectados y la terapéutica de prueba, y por lo tanto proporcionan un puente entre la investigación clínica y el mercado. Además, los modelos hiPSC son indefinidamente genes y proteínas en los niveles endógenos humanos renovables y expresa, el aumento de la probabilidad de que se recapitulan mecanismos de la enfermedad importantes.
Al igual que cualquier herramienta, sin embargo, las hiPSCs tienen limitaciones que deben tenerse en cuenta a la hora de elegir un modelo de la enfermedad. En efecto, el principal activo de las células madre pluripotentes - la capacidad de producir una gran variedad de tipos de células derivadas de los tres linajes germinales - puede ser un detrimento a menos tipos de células deseados pueden ser identificados y aislados, o al menos en gran medida enriquecidas. Si no, los experimentos posteriores se encuentran en riesgo de ser confundido por las influencias de variables de tipos de células desconocidos o no deseados que ocupan así la misma clase. Si se logra un enriquecimiento adecuado, también puede ser necesario para expandir las células y replantar en una variedad de superficies y diferenciarlas a un estado uniformemente maduro. Esta última tarea es particularmente importante, ya que las células madre pluripotentes son, en el fondo, modelos de sistemas de mini-desarrollo dinámicos. Como tal, es fácil de imaginar diferencias en los niveles de maduración dentro de las culturas hiPSC, que a su vez puede afectar el comportamiento fisiológico y los resultados experimentales. Para el control de esta fuente potencial de variabilidad, es útil usar cultivos de células derivadas de tejido primario como palos de medición de desarrollo para sus homólogos hiPSC-derivados. Por último, está la cuestión de la complejidad de la enfermedad. Más concretamente, ¿cuál es, a priori, la probabilidad de que un fenotipo de la enfermedad puede ser recapitulado en un tubo con un solo tipo de células? No hace falta decir que las enfermedades que requieren la participación de múltiples tipos de células o sistemas de órganos (y tal vez las influencias ambientales) plantean mayores, aunque no insuperables, desafíos.
Teniendo en cuenta las preocupaciones esbozadas anteriormente, la retina es un blanco atractivo para el modelado de la enfermedad basado en hiPSC, y no es de extrañar que la creación de líneas hiPSC de enfermedades específicas de retina está en plena vigencia. Protocolos existen ahora para la sólida generación y aislamiento del epitelio pigmentario de la retina (EPR) y la progenie neurorretiniano de fuentes de células madre pluripotentes humanas, incluyendo hiPSCs. Basado en trastornos RPE , en particular, parecen ser ideales para el modelado hiPSC, dada la facilidad y la medida en que este tipo de células se puede generar, aislada, estudiada, manipulada y probar. hiPSC-RPE puede crecer en parches pigmentados distintivos que pueden ser disecados manualmente, disociados y ampliados en una variedad de sustratos, donde forman monocapas y muestran numerosas funciones fisiológicas importantes in vitro similares a RPE humano primario prenatal.
Como tal, hiPSC-RPE ofrece un sinfín de oportunidades para poner a prueba los efectos celulares y moleculares de las mutaciones genéticas y / o perturbaciones ambientales. Por otra parte, el estado de maduración de hiPSC-RPE se puede controlar en cultivos vivos utilizando funciones y mediciones de la resistencia transepitelial morfológicas fácilmente discernibles, siendo el último indicativo de la formación de la unión estrecha y la polarización apropiada de la célula.
"Trastornos de epitelio pigmentario de la retina parecen ideales para el modelado de células madre pluripotentes inducidas humanas, dada la facilidad y la medida en que este tipo de células puede ser generada, aislado, estudiada, manipulada y probada."
Aprovechando las características de la cultura de RPE humana, Singh et al . recientemente desarrollado "modelo en un plato 'a hiPSC-RPE distrofia macular viteliforme de Best (BVMD). BVMD es una degeneración macular hereditaria causada por mutaciones autosómicas dominantes en la proteína de RPE-específica bestrofina-1 (BEST1). Curiosamente, RPE macular en BVMD permanece intacta incluso en el transcurso de la enfermedad, mientras que los fotorreceptores que observa degeneran con el tiempo, lo que lleva a la pérdida de la visión central. Este hallazgo sugiere que mutaciones BEST1 no son inmediatamente perjudiciales para las propias células del EPR, sino que conducen a interrupciones en la fisiología RPE que afectan a la salud de fotorreceptores a largo plazo. Consistente esta hipótesis, ya que en general no se observaron diferencias entre BVMD y control hiPSC-RPE a menos que se introdujo un estímulo fisiológico, tales como la exposición a los segmentos externos de los fotorreceptores o el agonista de los receptores purinérgicos, ATP. A raíz de estos retos, BVMD culturas hiPSC-RPE muestran fotorreceptores defectuosos, degradación del segmento exterior y la eliminación y la reducción de transporte de fluido, así como un aumento del estrés oxidativo celular.
Los autores utilizaron a continuación, este sistema para investigar el papel de BEST1 y definir parcialmente el mecanismo celular subyacente en BVMD, que parecía implicar interrupción de la homeostasis del calcio del retículo endoplásmico.
En contraste con hiPSC-RPE, la utilidad de los tipos de células NEURORRETINIANO hiPSC derivados para examinar fisiopatología de la enfermedad queda por determinar. Por ejemplo, dada la falta de producción de los segmentos externos de los fotorreceptores en cultivo, así como la escasez general de barras en la diferenciación de cultivos de células madre pluripotentes humanas, no está claro en qué medida los efectos de las mutaciones de rodopsina en la retinitis pigmentosa (RP) pueden ser investigado utilizando métodos de cultivo disponibles en la actualidad. Sin embargo, este problema puede ser evitado mediante la diferenciación de las culturas NEURORRETINIANO hiPSC derivados por períodos de tiempo más largos, el cocultivo con EPR o el trasplante de fotorreceptores (la progenie) en el tejido de la retina.
Curiosamente, algunas mutaciones RP basados en que los componentes de destino de la cascada de fototransducción puede ser propicio para el modelado hiPSC. Meyer et al .mostraron que, además de la expresión de genes clave de componentes fototransducción, las células madre pluripotentes humanos derivado de células de fotorreceptores-como exhibieron un cambio en el potencial de membrana en respuesta a exógenos 8-Br-GMPc que imitaba el interruptor de una luz adaptada a una oscuridad. Por lo tanto, las oportunidades existen probablemente para examinar los efectos funcionales de las mutaciones de los genes en fotorreceptores específicos utilizando hiPSCs, siempre y cuando las limitaciones del sistema de cultivo se tengan en cuenta.
Otra aplicación única de tecnología hiPSC a la modelización de enfermedad de la retina se ilustra por Tucker et al ., que utiliza hiPSCs de un paciente con RP esporádicos para verificar la patogenicidad de las inserciones Alu homocigotos no cubierto por exoma. En este elegante estudio, los autores encontraron que la inserción de la secuencia Alu en el exón 9 del paciente en el gen MAK impidió la expresión de una variante de empalme de MAK que normalmente se expresa en precursores de la retina. En este caso, hiPSCs ofrecen un medio eficaz no sólo para confirmar el defecto en el gen responsable de la enfermedad, pero también al mismo tiempo proporcionan una idea de su mecanismo.
Además de su potencial para modelar mecanismos de la enfermedad y evaluar la patogenicidad de mutaciones de genes, derivados de células de la retina hiPSC pueden ser utilizados para las pruebas de drogas, usando tanto de tipo externo e hiPSCs específicos del paciente para determinar los efectos de los agentes farmacológicos en función de la célula humana en condiciones normales y los estados de la enfermedad, respectivamente. Hasta la fecha, ha habido un número limitado de publicaciones mirando los efectos de los fármacos sobre las células retinianas hiPSC derivados. Meyer et al . informó el restablecimiento de la actividad de ornitina aminotransferasa en atrofia girada, hiPSC-RPE como siguiente tratamiento con vitamina B6. Los suplementos de vitamina B6 es un tratamiento conocido para la atrofia girada, sin embargo, el paciente en particular cuyos fibroblastos fueron utilizados para generar la línea de hiPSC se había considerado que no responde a la suplementación con vitamina B6 en virtud de las pruebas de sustitutos tradicionales. Por lo tanto, este estudio subraya la importancia potencial de la utilización de hiPSCs personalizados para poner a prueba los tipos de células reales (en este caso, EPR) dirigidos por una enfermedad con el fin de evaluar con mayor exactitud la eficacia del fármaco.
"Mirando hacia el futuro, es probable que la tecnología de células madre pluripotentes inducidas humanas tendrá un impacto amplio y significativo en el área de in vitro modelización de enfermedades, descubrimiento de fármacos y pruebas de terapia génica ".
En un segundo informe de Jin et al ., líneas hiPSC se crean a partir de pacientes con mutaciones asociadas a RP, incluyendo RP1, PRPH2, RHO y RP9. En este estudio, los autores observaron la muerte de las células en todas las líneas de la enfermedad entre los días 120 y 150. Sin embargo, el tratamiento con α-tocoferol dio lugar a una conservación estadísticamente significativa de células sólo en cultivos de retina que llevan la RD9 mutación. Por lo tanto, este estudio proporcionó la primera evidencia de que la tecnología hiPSC puede ser útil en la detección de las respuestas de drogas a través de numerosas enfermedades de la retina, relacionadas pero genéticamente distintas. Esta aplicación es especialmente importante para los trastornos genéticamente y fenotípicamente heterogéneas como la RP, y en última instancia, podría ayudar a reducir la lista de objetivos de la enfermedad de los medicamentos experimentales y mejorar el diseño de ensayos clínicos. Más allá de las pruebas personalizadas de agentes terapéuticos conocidos, hiPSC tecnología también ofrece una fuente ilimitada de material para los sistemas automatizados, de alto rendimiento de cribado de fármacos para interrogar bibliotecas de compuestos farmacológicos. Tales esfuerzos pueden descubrir rápidamente nuevos medicamentos para los trastornos previamente intratables.
Las pruebas de terapia génica es otra área en la que hiPSCs probablemente jugarán un papel importante en el futuro próximo. Corrección funcional de un defecto en el gen causante de la enfermedad retiniana se ha demostrado en hiPSCs específicos del paciente utilizando cromosoma artificial bacteriano mediado por recombinación homólogo, y este enfoque podría ser utilizado para reparar los genes en hiPSCs antes del trasplante autólogo. Sin embargo, la restauración de la función normal del gen en cultivos de hiPSC también debe ser alcanzable usando vectores virales que se están empleando actualmente en ensayos de terapia génica humana, siempre que el gen diana puede ser empaquetado y expresado apropiadamente. Tener sistemas de cultivo basados en hiPSC para las pruebas de terapia génica sería particularmente útil para enfermedades de la retina que no tienen modelos animales correspondientes para la demostración de la eficacia del tratamiento.
Mientras que el modelado y la prueba de progenie derivada de la retina hiPSC como cultivos adherentes es preferible para los trastornos de EPR y tal vez más conveniente para los que afectan a las células NEURORRETINIANO, puede ser más beneficioso en la última situación para generar una estructura de capas. Tales estructuras de tejido 3D podrían promover interacciones entre los tipos de células de la retina que normalmente se encuentran in vivo , y por lo tanto proporcionar una representación más precisa de los efectos de la enfermedad de la retina. En efecto, informes recientes han demostrado la formación de estructuras laminares, de múltiples fuentes de células pluripotentes, incluyendo las células madre embrionarias de ratón, células madre embrionarias humanas y hiPSCs, que tienen la capacidad añadida para formar sinapsis. La capacidad de generar estos tejidos retinales derivados de células madre pluripotentes, junto con el potencial de co-cultivo con RPE, ofrece el potencial para modelar enfermedades retinianas humanas complejas (por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad) en un nivel que no era posible anteriormente en la ciencia.
Mirando hacia el futuro, es probable que la tecnología hiPSC tendrá un impacto amplio y significativo en el área de la modelización in vitro de enfermedades, descubrimientos de fármacos y pruebas de terapia génica. Sin embargo, es una herramienta clínica o de laboratorio poco común que se puede soportar completamente por su cuenta. Por lo tanto, esperamos que los datos de los modelos hiPSC se combinarán con la información de los modelos de observación de animales y clínicas para proporcionar información muy necesaria sobre la fisiopatología de las enfermedades de la retina humana y las estrategias necesarias para superarlos.
Agradecimientos
DM Gamm ha recibido subvenciones de: NIH R01EY021218, programa de la Fundación Lucha contra la Ceguera Wynn-Gund Investigación Traslacional aceleración, Macula Fundación de Investigación de la Visión, E Fundación Matilda Ziegler, Beckman Iniciativa para la Investigación Macular, Fundación Reeves y la Fundación Comunitaria del Condado de Muskingum.
Fuente: NCBI
